РПГА тест на сифилис
ПРИНЦИП МЕТОДА
Антитела, присутствующие в сыворотке человека против бледной трепонемы (Treponema Pallidum) вызывают агглютинацию птичьих эритроцитов, сенсибилизированнх антигенным экстрактом T.pallidum1,2.
СОСТАВ
А Тестовые клетк. 15 mL. Стабилизированная суспензия птичьих эритроцитов, сенсибилизированная T. pallidum антигеном, азид натрия 0.95 gL.
В Контрольные клетки. 15 mL. Стабилизированная суспензия птичьих эритроцитов, азид натрия 0.95 g/L.
С+ Положительный контроль. 1 mL. Иммунная сыворотка животных, азид натрия 0.95 g/L.
С- Отрицательный контроль. 1 mL. Сыворотка, азид натрия 0.95 g/L.
D Реагент. 40 мл. Солевой фосфатный буфер, рН 7,2, экстракт Treponema Pallidum (Reiter), азид натрия 0.95 g/L.
ХРАНЕНИЕ
Хранение при 2-8°C.
Реагенты, Клетки и Контроли стабильны до срока годности, указанного на этикетке флаконов, при хранении плотно закрытыми и избежании загрязнения во время использования.
Показатели загрязнения:
Клетки: Видимая агглютинация во флаконе
Реагент и Контроли: Присутствие взвешенных частиц.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ
А Сенсибилизированные клетки и В контрольные клетки: Осторожно ресуспендировать флакон с реагентом до получения гомогенного состояния (примечание 1).
Реагент и Контроли готовы к использованию.
ДОПОЛНИТЕЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ
U-луночные (круглодонные) микропланшеты.
ОБРАЗЦЫ
Сыворотка или плазма, собранные по стандартной процедуре. Стабильно 2 дня при 2-8C.
Разведите сыворотку в пропорции 1/20 реагентом D. После разведения стабильность составляет 1 день при 2-8C. Для титрования положительных образцов сделайте серийные двукратные разведения с реагентом D, начиная с разведения 1/20.
ПРОЦЕДУРА
1.Позвольте реагентам прогреться до комнатной температуры
2.Налейте в дублях 25 мкл каждого разведенного образца, Положительного контроля (С+) и Отрицательного контроля (С-) в разные лунки микропланшета.
3.В первые лунки из двух повторов каждого образца и контроля налейте 75 мкл Сенсибилизированных клеток (А), а во вторые лунки – по 75 мкл Контрольных клеток (В)
4.Смешайте содержимое планшета осторожно покачивая его из стороны в сторону.
5.Закройте планшет крышкой и инкубируйте при комнатной температуре 15-30C в течение 1 часа.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Оцените наличие и модель клеточной агглютинации. Всегда сравнивайте результат с видом сенсибилизированных клеток в Контрольных лунках. Проведение Отрицательного контроля должно показывать рисунок полного отсутствия агглютинации в обеих лунках с тестовыми и контрольными клетками. Положительный контроль должен показывать четкую агглютинацию в лунках с тестовыми клетками, но не в лунках с контрольными клетками. Любая агглютинация, наблюдаемая в лунках с контрольными клетками, указывает на наличие неспецифических агглютининов. Проба, дающая такой результат, не может получить интерпертации. Проба с пограничным значением должна быть тестирована повторно и в случае, если получается аналогичный результат, сыворотка должна быть признана не реактивной (отрицательной).
Положительная сыворотка может быть раститрована. Для этого сделайте серийные двукратные разведения в дилюенте, начиная с разведения 1/20, тестируя каждый раз, как описано в шаге 2 – 4 процедуры (см. рис. 2). Титр сыворотки определяется ее наибольшим разведением, показывающим положительный результат.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Положительный С+ и отрицательный С- контроли, поставляемые в наборе, должны тестироваться совместно с образцами пациентов для верификации процедуры.
Положительный контроль С+ показывает ясно видимую агглютинацию Сенсибилизированных клеток (А), но не контрольных клеток (В).
Отрицательный контроль С- не вызывает агглютинации никакой агглютинации клеток.
Любая агглютинация, видимая в контрольных клетках (В) расценивается как неспецифическая. Образец, дающий такую реакцию, не может тестироваться на данном наборе.
Каждая лаборатория должна устанавливать собственные схемы внутреннего контроля качества и вносить коррективы в случае, если контроль качества не укладывается в допустимые пределы.
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Аналитическая чувствительность эквивалентна таковой при использовании Референсной Сыворотки Всемирной Организации Здравоохранения (WHO) для Диагностических Тестов Трепонемных инфекций, реф №3-1980 (институт Альфреда Фурнье).
Ложные результаты: Результаты, полученные с данными реагентами, не показали значимых отличий от референсных реагентов. Детали эксперимента предоставляются по запросу.
Хотя предпочтительно тетстировать сыворотку, можно также использовать и плазму, обработанную ЭДТА в качестве антикоагулянта. Однако. Так как были отмечены ложноположительные результаты на плазме, необходимо повторить тестирование с сывороткой для подтверждения результата.
ТПГА положительные результаты могут существовать длительное время после окончания заболевания. Данная методика не должна использоваться для оценки эффективности лечения.
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Присутствие антител к трепонеме в анализируемых пробах методом ТПГА является подтверждением диагностики сифилиса3. Хотя этот тест может давать ложно положительные результаты в случаях лекарственной терапии, проказы, инфекционного мононуклеоза и аутоиммунных заболеваний, частота положноположительных результатов значительно ниже по сравнению с трепонемными тестами4.
Клинический диагноз не должен основываться только на данных единичного теста, а должен включать в себя как клинические, так и лабораторные данные.
ПРИМЕЧАНИЯ
1. Храните флаконы в вертикальном положении. Хранение флаконов в горизонтальном положении может вызвать возникновение клеточных аггрегатов.
